Descripción

Principio
La muestra se ilumina con luz de una longitud de onda (o longitudes de onda) específica que es absorbida por los fluoróforos, lo que hace que emitan luz de longitudes de onda más largas (es decir, de un color diferente al de la luz absorbida). La luz de iluminación se separa de la fluorescencia emitida, mucho más débil, mediante el uso de un filtro de emisión espectral. Los componentes típicos de un microscopio de fluorescencia son una fuente de luz (las lámparas de vapor de mercurio HBO son comunes; las formas más avanzadas son los LED de alta potencia), el filtro de excitación, el espejo dicroico y el filtro de emisión. Los filtros y el espejo dicroico se eligen para que coincidan con las características espectrales de excitación y emisión del fluoróforo utilizado para marcar la muestra. De esta manera, se obtienen imágenes de la distribución de un solo fluoróforo (color) a la vez. Se deben componer imágenes multicolores de varios tipos de fluoróforos combinando varias imágenes de un solo color. La mayoría de los microscopios de fluorescencia que se utilizan son microscopios de epifluorescencia, donde la excitación del fluoróforo y la detección de la fluorescencia se realizan a través del mismo camino de luz (a través del objetivo). Estos microscopios se utilizan ampliamente en biología y son la base para diseños de microscopios más avanzados.

Microscopía de epifluorescencia
La mayoría de los microscopios de fluorescencia, especialmente los utilizados en las ciencias biológicas, tienen un diseño de epifluorescencia. La luz de la longitud de onda de excitación ilumina la muestra a través de la lente del objetivo. La fluorescencia emitida por la muestra se enfoca al detector mediante el mismo objetivo que se utiliza para la excitación, el cual para mayor resolución necesitará lentes objetivo con mayor apertura numérica. Dado que la mayor parte de la luz de excitación se transmite a través de la muestra, sólo la luz excitadora reflejada llega al objetivo junto con la luz emitida y, por lo tanto, el método de epifluorescencia proporciona una alta relación señal-ruido. El divisor de haz dicroico actúa como un filtro de longitud de onda específica, transmitiendo luz fluorescente al ocular o detector, pero reflejando cualquier luz de excitación restante hacia la fuente.